23.09.2020, 18:33

Биореактор внутри нас: как микробиота управляет метаболизмом хозяина

Всего сто лет назад микробов, живущих в человеческом кишечнике, считали нахлебниками и вредителями. В последние годы человеческую микробиоту стали называть своеобразным органом нашего тела, необходимым для нормальной жизнедеятельности организма.

Валерий Поройко

Теги:

Медицина

Биология

Климат

Интернет

тело

Биореактор внутри нас: как микробиота управляет метаболизмом хозяина

Со времен Пастера известно, что желудочно-кишечный тракт человека — это, по существу, биореактор проточного типа, в котором обитает множество микроорганизмов. Отношение ученых к микрофлоре кишечника за это время радикально изменилось. Лет сто назад великий Илья Мечников, основоположник современной теории иммунитета, за создание которой он получил Нобелевскую премию (на двоих со своим непримиримым оппонентом – не менее великим Паулем Эрлихом), предлагал даже удаление толстого кишечника как один из способов продления жизни. А тем, кому эта мера казалась слишком радикальной, рекомендовал пить как можно больше кефира, чтобы вытеснить вредных, по его мнению, микробов полезными лактобактериями. Через полвека курс изменился на 180 градусов. Оказалось, что нормальная микрофлора кишечника, а также кожи и слизистых оболочек выполняет множество полезных функций — например, подавляет жизнедеятельность постоянно атакующих организм патогенных микроорганизмов. А в последние годы самые смелые из микробиологов пошли еще дальше, объявив человека и его микробов единым симбиотическим сверхорганизмом.

Развитие методов молекулярной биологии вывело ученых на новый уровень понимания процессов симбиоза человека и его микрофлоры, которые казались хорошо изученными и от дальнейшего изучения которых не ждали особых сюрпризов. Стремительный рост скорости и падение стоимости методов секвенирования ДНК (определения ее нуклеотидной последовательности) и параллельный рост мощности персональных компьютеров и развитие интернета дали возможность анализировать информацию о крупных участках геномов. После того как были расшифрованы хромосомы сотен видов отдельных бактерий, в генетике микроорганизмов появился новый подход — популяционный: анализ генов сразу всех бактерий, населяющих определенный ареал. Разумеется, население «человеческого биореактора» оказалось одной из наиболее важных для изучения микробных популяций.

Первая работа, заставившая совершенно по-новому взглянуть на кишечную микробиоту, была опубликована в 1999 году группой ученых из Национального института агрономических исследований (Франция) и Университета Ридинга (Великобритания). Авторы решили применить для исследования микробной популяции кишечника метод секвенирования генов 16S РНК (см. врезку «16S PHK — удостоверение личности бактерии»).

Первый этап определения микроорганизмов — их культивирование на питательных средах. Но ряд микробов не желают расти ни на одной из сред.
Изучать ранее недоступные некультивируемые бактерии и начать наводить порядок в донельзя запутанной систематике уже известных прокариот стало возможным с развитием биоинформатики и появлением современных методов молекулярной биологии – полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей из одного участка ДНК получить миллионы и миллиарды точных копий, клонирования выделенных с помощью ПЦР генов в бактериальных плазмидах и методик секвенирования последовательностей нуклеотидов, полученных в результате всего этого в достаточном для анализа количестве. Идеальным маркером для идентификации микроорганизмов оказался ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК (каждая из двух субъединиц рибосом – клеточных мастерских по синтезу белка – состоит из переплетенных молекул белков и цепочек рибонуклеиновых кислот).
Этот ген есть в геноме всех известных бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, и если вы нашли характерную для него последовательность нуклеотидов – вы точно имеете дело с генами прокариот. (Если быть очень точным, ген 16S РНК есть и у эукариот, но не в ядерных хромосомах, а в митохондриальных. Это еще раз подтверждает, что митохондрии – отдаленные потомки бактерий-симбионтов первых эукариотических организмов.) Этот ген имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные. Консервативные участки служат для первого этапа полимеразной цепной реакции – присоединения исследуемой ДНК к праймерам (затравочным участкам ДНК, к которым изучаемая цепочка нуклеотидов должна присоединиться для начала анализа остальной последовательности), а видоспецифичные – для определения видов. К тому же степень схожести видоспецифичных участков очень хорошо отражает эволюционное родство разных видов. Дополнительный бонус – для клонирования и последующего анализа можно использовать саму рибосомальную РНК, которая в любой клетке присутствует в гораздо большем количестве, чем соответствующий ей ген. Только надо сначала «переписать» ее в ДНК с помощью специального фермента – обратной транскриптазы.
Нуклеотидные последовательности 16S РНК всех известных бактерий и архей (около 10 000 видов) общедоступны. Выявленные последовательности сравнивают с имеющимися в базах данных и точно идентифицируют вид бактерии или объявляют ее принадлежащей к очередному некультивируемому виду.
В последнее время идет интенсивный пересмотр старой, фенотипической, классификации бактерий, основанной на плохо формализуемых критериях – от внешнего вида колоний до пищевых предпочтений и способности окрашиваться разными красителями. Новая систематика опирается на молекулярные критерии (16S РНК) и только отчасти повторяет фенотипическую.

Что у нас внутри

Кодирующие последовательности 16S РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) извлекали непосредственно из «окружающей среды» — 125 мг человеческого, извините, стула встраивали в плазмиды кишечной палочки (не потому, что она кишечная, а потому, что Escherichia coli — одна из любимых рабочих лошадок молекулярных биологов) и снова выделяли из культуры размножившихся бактерий. Таким образом была создана библиотека генов 16S РНК всех микроорганизмов, находившихся в образце. После этого случайным образом было отобрано и секвенировано 284 клона. Оказалось, что только 24% полученных последовательностей 16S РНК принадлежали известным ранее микроорганизмам. Три четверти микрофлоры, находящейся в кишечнике каждого человека, больше сотни лет избегали внимания исследователей, вооруженных методами классической микробиологии! Ученые просто не могли подобрать условия для культивирования этих бактерий, потому что самые капризные обитатели кишечника отказывались расти на традиционных микробиологических средах.

На сегодняшний день при помощи молекулярных методов установлено, что в микробиоте взрослого человека представлены 10 из 70 крупных бактериальных таксонов. Около 90% наших микробов принадлежат к типам Firmicutes (к ним относятся, например, всем известные лактобактерии — основные «виновники» скисания молока) и Bacteroidetes — облигатные анаэробы (организмы, способные жить только в отсутствие кислорода), которые часто используются в качестве индикатора загрязнения природных вод канализационными стоками. Оставшиеся 10% популяции поделены между таксонами Proteo-bacteria (к ним относится, среди прочих, и кишечная палочка), Actinobacteria (из одного из видов актиномицетов был выделен антибиотик стрептомицин), Fusobacteria (обычные обитатели ротовой полости и частая причина пародонтоза), Verrucomicrobia (недавно в геотермальном источнике был обнаружен вид этих микробов, питающихся метаном, которого в кишечнике предостаточно благодаря жизнедеятельности других микроорганизмов), Cyanobacteria (их до сих пор часто называют по-старому — «сине-зелеными водорослями»), Spirochaeates (по счастью, не бледные), Synergistes и VadinBE97 (что это за звери, спросите у создателей новой систематики прокариот).

От младенчества до старости

Несмотря на то что видовой состав микроорганизмов кишечника достаточно однообразен, количественное соотношение представителей определенных систематических групп в микробиоте разных людей может сильно варьировать. Но что же представляет из себя нормальная кишечная микрофлора и каковы пути ее формирования?

На этот вопрос был дан ответ в опубликованной в 2007 году работе группы американских биологов под руководством Патрика Брауна из Стэнфордского университета. Они проследили формирование микробиоты у 14 новорожденных младенцев на протяжении первого года жизни. Авторам удалось установить несколько источников колонизации желудочно-кишечного тракта. Микробиота младенцев имела сходство с микрофлорой матери: вагинальной, фекальной или с микрофлорой образцов грудного молока. В зависимости от источников колонизации, в микрофлоре кишечника младенцев на протяжении первого года жизни преобладали различные виды. Эти различия оставались значительными на протяжении всего периода исследования, однако к годовалому возрасту становились заметны черты формирования взрослой микробиоты. Интересные данные были получены на примере пары близнецов. Микрофлора у них была практически идентичной по составу и менялась тоже одинаково. Эта находка выявила огромную роль человеческой составляющей пары «микробиота-хозяин» в формировании популяции кишечной микрофлоры. Для чистоты эксперимента, конечно, следовало бы разлучить младенцев еще в роддоме (кстати, прекрасный сюжет для индийского фильма! Спустя годы близнецы узнают друг друга по анализам микрофлоры...). Но данные других работ подтвердили предположение, что индивидуальные, в том числе наследственно обусловленные, особенности биохимии человека оказывают большое влияние на состав его микробиоты.

Кроме изучения отдельных видов кишечной микрофлоры, в последние годы многие исследователи изучают бактериальный метагеном – совокупность генов всех микроорганизмов в пробе содержимого человеческого кишечника (или в смыве с кожи, или в пробе ила с морского дна).
Для этого используют самые автоматизированные, компьютеризированные и высокопроизводительные технологии секвенирования ДНК, дающие возможность анализировать короткие последовательности нуклеотидов, собирать головоломку по нескольким совпадающим «буквам» на концах этих участков, многократно повторять эту процедуру для каждого кусочка генома и получать расшифровку отдельных генов и хромосом со скоростью до 14 миллионов нуклеотидов в час – на порядки быстрее, чем это делалось всего несколько лет назад. Так было установлено, что микробиота кишечника насчитывает примерно 100 триллионов бактериальных клеток – примерно в 10 раз больше, чем общее число клеток человеческого тела.
Набор генов, входящих в состав бактериального метагенома, примерно в 100 раз превышает набор генов человеческого организма. Если говорить об объеме биохимических реакций, протекающих внутри микробной популяции, он опять же многократно превышает таковой в организме человека.
Бактериальный «реактор» реализует в организме хозяина метаболические цепочки, которые тот не способен поддерживать сам – например, синтез витаминов и их предшественников, разложение некоторых токсинов, разложение целлюлозы до усвояемых полисахаридов (у жвачных животных) и т.д.

Худые и толстые

Исследования, проведенные в лаборатории Джефри Гордона (Школа медицины при Университете Вашингтона, Сент-Луис, Миссури), позволили связать видовое разнообразие бактерий желудочно-кишечного тракта с диетой и особенностями обмена веществ индивидуума. Результаты эксперимента опубликованы в декабрьском номере журнала Nature за 2006 год. Годичный эксперимент предполагал установить корреляцию между избытком веса у человека и составом микробной популяции его кишечника. Дюжину толстяков, согласившихся положить свои животы на алтарь науки, разделили на две группы. Одна села на диету с низким содержанием жиров, вторая — с низким содержанием углеводов. Все добровольцы худели, и одновременно у них менялось соотношение двух основных групп микроорганизмов кишечника: количество клеток Firmicutes снижалось, а количество Bacteroidetes, наоборот, росло. На обезжиренной диете такое изменение становилось заметным позже — после того, как пациенты теряли 6% веса, а на низкоуглеводной — после потери первых килограммов (2% исходной массы тела). При этом изменение состава микрофлоры было тем больше выражено, чем меньше становился вес участников эксперимента.

Борьба с ожирением

Результаты дальнейшего изучения учеными изменений симбиотического мышино-микробного организма (см. врезку «Проверено на мышах») блестяще подтвердили гипотезу о том, что микробиота тучных индивидуумов способствует более глубокой переработке пищи. Сравнение образцов ДНК стула тучных и нормальных мышей показало, что микробиом тучных мышей насыщен генами ферментов, позволяющих более эффективно разлагать полисахариды. Кишечник тучных мышей содержал большие количества конечных продуктов ферментации — соединений уксусной и масляной кислот, что указывает на более глубокую переработку компонентов пищи. Калориметрический (от слова «калории»!) анализ образцов мышиного стула подтвердил это: стул ob/ob-мышей содержал меньшее число калорий, чем у мышей дикого типа, которые не так полно усваивали энергию из пищи.

Параллельно в той же лаборатории проводились эксперименты на лабораторных мышах, несущих мутацию в гене лептина – «гормона сытости», белка, который синтезируется в клетках жировой ткани и вкладывает свою лепту в формирование чувства насыщения. Мыши, у которых повреждены обе копии этого гена, едят на 70% больше, чем дикий тип, со всеми вытекающими из этого последствиями. А содержание Firmicutes в их кишечнике в полтора раза выше, чем у гетерозиготных линий, с только одной бракованной аллелью (ob/+), и гомозиготных по нормальному гену линий дикого типа (+/+).
Влияние микрофлоры на обмен веществ ее «хозяина» исследователи проверили на еще одной модели – гнотобиотических мышах. Таких животных, с момента рождения живущих в стерильных камерах и ни разу в жизни не встречавшихся ни с одним микробом, используют в биомедицинских исследованиях не часто. Абсолютная стерильность в мышатнике, крольчатнике и тем более козьем хлеву – дело дорогое и хлопотное, а после встречи с первым же микробом или вирусом бедняги или умрут, или станут непригодными к дальнейшим экспериментам. Что происходит у гнотобиотов с иммунной системой – отдельная история, а едят они за троих и при этом – кожа да кости из-за отсутствия микробного компонента пищеварения.
После пересадки микрофлоры от тучных (ob/ob) доноров мыши-гнотобиоты за две недели растолстели почти в полтора раза (на 47%). Те, которых «засеяли» микрофлорой от доноров дикого типа (+/+) с нормальным весом, поправились только на 27%.

Помимо важной информации о «микробной» составляющей ожирения авторам удалось показать принципиальную схожесть микрофлор страдающих ожирением людей и мышей, что открывает новые перспективы в исследовании проблемы избыточного веса, а возможно, и разрешения этой проблемы путем «пересадки» здоровой микрофлоры или ее формирования у пациентов, страдающих ожирением.

И с истощением

То, что микробиота может управлять метаболизмом хозяина, уже не вызывает сомнения. Исследования лаборатории Гордона, посвященные проблеме излишнего веса, позволили перекинуть мостик к лечению метаболических заболеваний. Среди них такие виды общего истощения, поражающие детей от года до четырех лет в бедных странах с тропическим климатом, как маразмус (к маразму это слово имеет лишь лингвистическое отношение: греч. marasmoz дословно означает истощение, угасание) и квашиоркор (на языке одного из племен Ганы kwashiorkor — «красный мальчик»). Возникновение заболеваний связывают с недостатком белков и витаминов при переходе от грудного вскармливания на взрослую пищу. Но заболевания выборочно поражают детей, чьи братья и сестры не испытывали никаких проблем с переходом на традиционный для данного региона рацион. Исследования показали, что кишечная микрофлора больных детей разительно отличается от микрофлоры их родителей, а также от микрофлоры здоровых братьев и сестер. Прежде всего отмечалось практически полное отсутствие в кишечной популяции Bacteroidetes и доминирование редких видов, относящихся к типам Proteobacteria и Fusobacteria. После того как больных детей (аккуратно, чтобы не передозировать!) откармливали усиленно-белковой пищей, их микробиота становилась похожей на нормальную, такую, как у родственников, с преобладанием Bactеroidetes и Firmicutes.

Исследования последних лет не только коренным образом изменили сложившиеся представления о кишечной микрофлоре человека, но и способствовали появлению концепции, рассматривающей микробиоту кишечника как дополнительный многоклеточный «орган» человека. Орган, состоящий из различных линий клеток, способных общаться как между собой, так и с организмом хозяина. Орган, перераспределяющий энергетические потоки, осуществляющий важные физиологические реакции, изменяющийся под воздействием среды и самовосстанавливающийся при изменениях, вызванных внешними условиями. Продолжение исследования «бактериального органа» может и должно привести к пониманию законов его функционирования, раскрытию его тонких связей с организмом хозяина и, как следствие, к возникновению новых методов борьбы с болезнями человека путем целенаправленного лечения дисфункций обеих составляющих метаорганизма.