Фабрика вирусов: как в России разрабатывают и производят вакцины

Для массового выращивания вирусов биологи десятилетиями использовали куриные эмбрионы. Недолго подержав оплодотворенные яйца в инкубаторе, в них тонкой иглой вводили инфицированную суспензию.

«В результате вместо цыпленка получалась такая неприятная жижа, из которой выделяли вирусы, – рассказывает биотехнолог из компании Sartorius Павел Гнеденков. – Чтобы получить "мертвую" вакцину, препарат дополнительно обрабатывали чем-нибудь, что убивает сам вирус (например, разрушая его ДНК), но сохраняет нетронутой белковую оболочку. Классический вариант – формальдегид».

Дальше оставалось лишь смешать вирусы с адъювантом (усилителем иммунного ответа), и вакцина готова. Как правило, в роли адъюванта выступает гидроксид алюминия. Он нерастворим и остается в области укола, удерживая на себе вирусные частицы. На первом этапе их повышенная концентрация стимулирует иммунитет, а затем гидроксид постепенно вымывается и выводится из организма. Последний шаг – разлить препарат по ампулам и развезти их в пункты вакцинации.

Данная технология применяется и сегодня: она редко дает побочные эффекты. В частности, на основе инактивированных вирусов производят вакцины от гриппа и полиомиелита. Иногда вирус не убивают, а ослабляют: так он уже не в силах вызвать саму болезнь, но вполне способен спровоцировать иммунный ответ. Однако иногда вирус может неожиданно вернуться к своему природному агрессивному состоянию и стать причиной заболевания с тяжелым течением.

«Работа с куриными эмбрионами и яйцами достаточно сложная и грязная. А применение живых вирусов создает угрозу для персонала, требуя особых мер предосторожности, – продолжает Павел. – Поэтому сейчас в лабораториях используют более "цивилизованные" методы получения вакцин».

Генная инженерия позволяет брать вирусы, которые не представляют серьезной угрозы для человека, дополняя их отдельными белками целевого вируса, вызывающего болезнь, – биологическим вектором. А выращивать их можно в культуре клеток in vitro, в биореакторах.«Тут защищать требуется не столько сотрудников, сколько продукт – от заражения со стороны людей», – добавляет Павел Гнеденков.

Пожалуй, самый известный пример векторной вакцины – «Спутник V», разработанный в НИЦ эпидемиологии и микробиологии (НИЦЭМ) им. Н. Ф. Гамалеи. Здесь используются практически безвредные аденовирусы, несущие белки возбудителя COVID-19 и на всякий случай дополнительно покалеченные.

«В данном случае у них отрезан фрагмент генома, который отвечает за репликацию, – объясняет Павел. – Они попадают в организм и реплицируются только один раз, вызывая иммунный ответ. Новое поколение уже не в состоянии заразить клетки, и на этом все завершается. Теоретически такие вирусы можно хоть ложкой есть».

Поврежденные вирусы неспособны размножаться в организме, так что вырастить их на куриных эмбрионах не получится. Для этого берут отдельные клетки, у которых нет собственного иммунитета и защиты перед инфекцией. Чаще других используют клетки линии Vero, некогда позаимствованные у зеленых макак, и линии BHK-21, полученной от хомячков. А «Спутник V» создан на основе линии эмбриональных почек человека (HEK 293). Рост и размножение клеток, их заражение и гибель – все происходит внутри реактора объемом до нескольких тысяч литров.

«Если вы собрались производить вакцину, вам придется заключить договор с ее разработчиком. Он может предоставить полный технологический процесс и сами ГМ-вирусы, содержащие векторы, – комментирует Павел Гнеденков. – Далее понадобятся клетки для размножения вирусов и оборудование, чтобы их культивировать. Это очень сложная задача, недаром культуру клеток впервые вырастили в лаборатории еще в начале прошлого века, а довести процесс до промышленных масштабов удалось только в 1990-х».

С микробами таких проблем нет: каждая бактерия – это отдельное живое существо, которое умеет самостоятельно питаться и защищаться от заражения. Клетки многоклеточных же высокоспециализированны и адаптированы к выживанию лишь внутри организма. Они не усваивают ничего, что не было бы предварительно переварено. Им требуется готовый набор питательных веществ, гормоны и витамины в строго определенных количествах, факторы роста, оптимальная кислотность среды и концентрация кислорода, гарантированная стерильность.

«На сегодняшний день клеточные реакторы представляют собой одноразовые системы. Например, наша компания поставляет герметичные контейнеры, которые содержат все необходимое. Подача воздуха, системы перемешивания и аэрации – все встроено и привозится уже готовым, – говорит Павел. – Такой подход существенно снижает риски производства. Ведь если что-то пойдет не так – например, реактор зарастет плесенью или клетки погибнут от заражения – то в потери придется записать стоимость не только партии загубленного продукта, но и среды для клеток. А среда – штука сложная и дорогая. Она содержит сотни компонентов и стоит порядка 100–200 евро за литр, причем на загрузку реактора требуется несколько сотен или тысяч литров».

Количество клеток в реакторе удваивается каждые 12 часов, и для набора нужного количества биомассы обычно хватает пары дней. После этого среду заражают и проводят еще один цикл культивирования, получая клетки, набитые вирусными частицами. Чтобы их извлечь, клетки разрушают – лизируют, например добавлением соли. Получается раствор, содержащий фрагменты мертвых клеток и вирусы, а также белки и массу других обломков. Далее жидкость фильтруют, прогоняя через мембраны, поры в которых настолько малы, что просочиться сквозь них могут далеко не все частицы.

«Чаще всего применяется тангенциальная фильтрация, – продолжает Павел Гнеденков. – Поток жидкости направляется не поперек, а вдоль мембраны, которая пропускает только молекулы определенного размера; остальное уносится дальше. Сперва удаляется все, что крупнее вируса, потом все, что мельче него».

Полученный препарат проверяют на чистоту и концентрацию вирусов, дополняют адъювантом и отправляют на разлив. Здесь включается еще одна высокотехнологичная система, которая проводит все операции автоматически, в стерильных условиях и без участия человека, отмеривая нужные дозы в банки, ампулы или шприцы. Вакцина готова, на весь цикл ушло около недели.

«Естественно, в реальной жизни может произойти что угодно, особенно перед запуском производства. Ведь даже если процесс отработан на небольших объемах, его еще надо масштабировать под реальное предприятие, – предупреждает Павел. – Для этого проводятся предварительные эксперименты. В крупных компаниях есть отделы масштабирования с реакторами небольших размеров – от нескольких литров до пары сотен. Специалисты стараются учесть все нюансы перед передачей процесса в производство».

Много подобных предприятий не требуется. Например, над обеспечением всех российских и зарубежных покупателей «Спутником V» трудились всего три компании: кроме НИЦЭМ им. Гамалеи этим занимались «Биннофарм», «Биокад» и «Генериум» – крупнейший из производителей, который использовал три основных реактора объемом около 2000 л каждый. Все они круглосуточно нарабатывали ГМ-вирусы.

«Как и вся фармацевтическая промышленность, такие компании работают в соответствии со стандартом GMP – Good Management Practice, "надлежащая производственная практика", – объясняет Павел Гнеденков. – Иногда его еще расшифровывают как Give More Paper, "дайте больше бумаги". И это только отчасти шутка, поскольку в рамках GMP каждый шаг, каждое движение должно быть тщательно задокументировано. И если ты в точности выполняешь все шаги, описанные на бумаге, то все будет правильно: ты получишь чистый и предсказуемый продукт, колоть который не только безвредно, но и полезно».